Reporter Emission Multiplexing steigert die Multiplex-Kapazität in der digitalen PCR

Populations-spezifische Reporter ermöglichen den präzisen Nachweis zusätzlicher DNA-Zielsequenzen über die Anzahl an Fluoreszenz-Detektionskanälen hinaus

Emission Multiplexing (REM) werden zielsequenz-unabhängige Reporter mit Fluoreszenzmarkierung genutzt, die während einer digitalen PCR mehrere distinkte Fluoreszenzsignale unterscheidbarer Intensität in einem Detektionskanal generieren (Calabrese et al.¹). Dies führt zu einer Vervielfachung der Multiplex-Kapazitäten über die Anzahl an Detektionskanälen hinaus.

Gleichzeitiger Nachweis von mutierter DNA und Wildtyp-DNA als gBlock-DNA-Sequenzen in nur einem Fluoreszenzkanal Kanal mittels Reporter Emission Multiplexing, bei unterschiedlichen Konzentrationen (Naica®Prism6)

Gleichzeitiger Nachweis von mutierter DNA und Wildtyp-DNA als gBlock-DNA-Sequenzen in nur einem Fluoreszenzkanal Kanal mittels Reporter Emission Multiplexing, bei unterschiedlichen Konzentrationen (QIAcuity)

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Da die hierfür eingesetzten Reportermoleküle zielsequenz-unabhängig sind, können komplexere Modifikationslayouts und/oder Konfigurationen genutzt werden, um die Intensitäten der Fluoreszenzsignale einzustellen. Diese Reporter sind folglich populationsspezifisch (populationsspezifische Reporter/ PSR) und werden durch Mediatorsequenzen aktiviert, welche während der digitalen PCR durch basenspezifische Spaltung einer Mediatorsonde freisetzen (Schlenker et al.²). So können sogar Punktmutationen (SNPs) hoch spezifisch von Wildtyp-DNA unterschieden werden.

Ohne Änderungen an der Gerätehardware vornehmen zu müssen erhöht das Reporter Emission Multiplexing so die Multiplex-Grade in der digitalen PCR und bewirkt eine Maximierung der Spezifität und Sensitivität beim Nachweis von DNA-Zielsequenzen.Entsprechende Hochmultiplex-Assays konnten bereits für verschiedene Geräte (z.B. Naica® Prism6, Nio® und QIACuity®) entwickelt werden, wodurch sie ideal geeignet sind für Anwendungsfelder der digitalen PCR wie die Onkologie, Liquid-Biopsy, Pathogen-Bestimmung oder Pflanzenzucht.

Das Reporter Emission Multiplexing ist durch Hahn-Schickard zum Patent angemeldet. Wenn Sie Interesse an der Technologie haben, freuen wir uns über Ihre Anfrage.

Literaturangaben

1. Reporter emission multiplexing in digital PCRs (REM-dPCRs). Silvia Calabrese, Anja M. Markl, Maximilian Neugebauer, Stefanie J. Krauth, Nadine Borst, Felix von Stetten and  Michael Lehnert. Analyst 2023, DOI:10.1039/D3AN00191A
2. Stringent Base Specific and Optimization-Free Multiplex Mediator Probe ddPCR for the Quantification of Point Mutations in Circulating Tumor DNA. F. Schlenker, E. Kipf, M. Deuter, I. Höffkes, M. Lehnert, R. Zengerle, F. von Stetten, F. Scherer, J. Wehrle, N. von Bubnoff, P. Juelg, T. Hutzenlaub, N. Borst. Cancers 2021. DOI: 10.3390/cancers13225742

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